99re热这里只有精品,小受夹道具羞耻h调教play,国产黄a三级三级三级看三级,亚洲欧美另类日本人人澡

歡迎光臨北京和一生物科技有限公司網(wǎng)站!
誠信促進發(fā)展,實力鑄就品牌
服務熱線:

18102086003

產(chǎn)品分類

Product category

技術(shù)文章 / article 您的位置:網(wǎng)站首頁 > 技術(shù)文章 > 原核表達操作步驟及注意事項

原核表達操作步驟及注意事項

發(fā)布時間: 2020-12-17  點擊次數(shù): 1954次

將克隆化基因插入合適載體后導入大腸桿菌用于表達大量蛋白質(zhì)的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用。大腸桿菌用于表達重組蛋白有以下特點:

易于生長和控制;用于細菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動物細胞系統(tǒng)的材料昂貴;有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)??晒┻x擇。但是,在大腸桿菌中表達的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工,常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構(gòu)象。

表達載體在基因工程中具有十分重要的作用,原核表達載體通常為質(zhì)粒,典型的表達載體應具有以下幾種元件:

(1)選擇標志的編碼序列;

(2)可控轉(zhuǎn)錄的啟動子;

(3)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子,核糖體結(jié)合位點);

(4)一個多限制酶切位點接頭;

(5)宿主體內(nèi)自主復制的序列。

原核表達一般程序如下:

獲得目的基因-準備表達載體-將目的基因插入表達載體中(測序驗證)-轉(zhuǎn)化表達宿主菌-誘導靶蛋白的表達-表達蛋白的分析-擴增、純化、進一步檢測

一、試劑準備

1、LB培養(yǎng)基。

2、100mM IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm濾膜抽濾,-20℃保存。

二、操作步驟

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第yi鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

(二)構(gòu)建重組表達載體

1、載體酶切:將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種

1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。

2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。

(四)誘導表達

1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 ≌0.4-1.0(OD600 0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

4、分別取菌體1ml,離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻,70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

三、注意事項

1、選擇表達載體時,要根據(jù)所表達蛋白的終應用考慮。如為方便純化,可選擇融合表達;如為獲得天然蛋白,可選擇非融合表達。

2、融合表達時在選擇外源DNA同載體分子連接反應時,對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。

聯(lián)


欧美大黑bbbbbbbbb| 国产小呦泬泬99精品| 又硬又粗进去好爽a片潘金莲| 肉丝祙少妇VR做爰视频| 久久综合亚洲鲁鲁五月天| 亚洲av无码成人精品区狼人影院| 偷妻之寂寞难耐2中文字幕| 精品人妻一区二区三区四区在线| 午夜亚洲国产理论片2020| 一路向西在线| 被下人玩弄的嫡女np| 免费精品99久久国产综合精品| 秘书跪趴撅着给人玩弄| 国产大片免费观看软件| 黑人巨大精品欧美黑寡妇| 亚洲av久久无码| 欧美日韩亚洲精品瑜伽裤| 国内少妇人妻偷人精品免费视频| 大学生粉嫩无套流白浆| 被调教的少妇雅芳1一19| 人人添人人澡人人澡人人人人| 国产69精品久久久久人妻| 两口子交换真实刺激高潮| 精品免费久久久久久久| 迷晕女同学强脱白色长袜| 富婆性俱乐部纵欲狂| 日本护士XXXXHD少妇| sss极品尤物▌missa▌| 少妇无套内谢久久久久| 久久亚洲熟女cc98cm| cao死你小sao货湿透了np| 丰满爆乳无码一区二区三区| 久久久久蜜桃精品成人片| 国产精品无码无卡毛片不卡视| 中文字幕亚洲欧美日韩在线不卡| 正文 畸情~(20)小茹的| 亚洲av无码国产精品夜色午夜| 古代妓院做爰片120分钟| 胸大喂奶h玩弄爽到失禁n| 日本动态120秒免费| 亚洲精品成人a在线观看|